盐生草Actin基因片段的克隆及表达

根据藜科植物的肌动蛋白(Actin)基因编码区保守序列设计一对简并引物,提取盐生草(Halogeton glomeratus)叶片的总RNA,运用RT-PCR技术扩增出Actin基因的核心序列并连接到pMD19-T载体,阳性克隆经PCR检测后进行测序。序列分析表明,盐生草Actin基因核心序列长度为598bp,编码198个氨基酸,并在GenBank中注册,登录号为KF699314,由盐生草Actin基因推导的氨基酸序列与其他几种耐盐植物的同源性均在94%以上,具有高度的保守性。采用荧光定量RT-PCR技术分析其Actin基因在盐生草不同器官的表达情况,结果显示其表达量恒定无差异,表明克隆的Actin基因可作为盐生草内参基因来研究其相关耐盐基因的表达。     

大麦条纹病病菌对大麦叶片防御酶活性的影响

为探究大麦对条纹病菌侵染的生理响应机制,以高感品种Alexis为试验材料,测定接种大麦条纹病病菌后0、3、6、9和12 d不同时间点的大麦叶片内防御酶及叶绿素相对含量的变化。结果表明:随着侵染时间的延长,超氧化物歧化酶活性、脯氨酸含量和过氧化氢酶的活性先上升后下降,与对照相比,平均增幅分别为27.58%、70.55%、32.71%;过氧化物酶在接种后第6天略有下降,但整体呈上升趋势,平均增幅为39.38%;丙二醛和叶绿素相对含量呈下降趋势,且均低于对照,平均降幅为11.21%、46.39%,病害越重,叶绿素下降的幅度越大,最大降幅为84.34%。综上所述,高感品种Alexis在不同时间段应答大麦条纹病病菌胁迫的生理生化反应不同。     

104份甘肃小麦品种脂肪氧化酶和多酚氧化酶活性基因等位变异的检测

面粉和面制品的色泽是评价小麦品质的重要指标。小麦脂肪氧化酶(LOX)和多酚氧化酶(PPO)活性对面粉白度及面制品的色泽具有重要影响。为给甘肃省小麦品质育种提供参考依据,以104份甘肃省育成的小麦品种为材料,利用功能标记LOX16、LOX18、PPO18、PPO16和PPO29检测TaLox-B1、PpoA1及Ppo-D1位点的等位变异,分析甘肃小麦品种资源中LOX和PPO活性基因的组成和分布特点。结果表明,在甘肃小麦中,等位变异TaLox-B1a和TaLox-B1b的频率分别为22.12%和77.88%;其中,甘肃冬小麦品种高LOX活性等位变异TaLox-B1a的分布频率(30.56%)高于春小麦(3.13%)。等位变异Ppo-A1a、PpoA1b、Ppo-D1a和Ppo-D1b的频率分别为49.04%、50.96%、50.96%和49.04%;两个PPO基因的等位变异组合Ppo-A1a/Ppo-D1b、Ppo-A1a/Ppo-D1a、Ppo-A1b/Ppo-D1b和Ppo-A1b/Ppo-D1a的分布频率依次为28.85%、20.19%、20.19%和30.77%。说明在甘肃小麦品种中,低LOX活性等位变异(TaLox-B1b)品种比例较高;低PPO活性等位变异(Ppo-A1b、Ppo-D1a)品种分布比例略高于高PPO活性类型;其中,32份小麦品种在TaLox-B1、Ppo-A1和Ppo-D1三个位点同时含有高LOX活性和低PPO活性的等位变异。     

冬小麦品种（系）品质相关基因的分子标记检测

为了解10年来中国冬小麦育成品种（系）的面筋强度、黄色素含量、多酚氧化酶(PPO)活性以及1BL·1RS易位相关基因的分布情况,利用Dx5、By8、YP7A、PPO18和H2O特异性功能标记对266份冬小麦品种（系）进行检测。结果表明,面筋强度相关基因 Dx5和 By8的分布频率分别为32.0%和28.9%,PPO活性相关基因 Ppo-A1a和 PPo-A1b的分布频率分别为54.1%和45.9%,黄色素含量相关基因 Psy-A1a和 Psy-A1b的分布频率分别为76.3%和23.7％,1BL·1RS易位基因型的分布频率为45.9%。不同省份之间品质相关基因分布差异较大,1BL·1RS易位在江苏、河南和陕西品种（系）中出现的频率较高,分别为81.3%、57.2%和35.7%,而在河北、山东和北京品种（系）中出现的频率较低,分别为15.0%、8.7%和8.3%; Dx5和 By8在河北、山东品种中出现的频率较高,分别为60.9%、65.2%和45.0%、45.0%; Ppo-A1b和 Pys-A1a在山东、北京、河北品种（系）中出现的频率较高,分别为95.7%、83.3%、75.0%和100.0%、83.3%、80.0%。筛选到 Psy-A1b/PPo-A1b/ Dx5/By8和 Psy-A1a/ PPo-A1b/ Dx5/ By8基因聚合且不含1BL·1RS易位的品种（系）分别有2和23份,可作为优质面条小麦育种的亲本材料;筛选到 Psy-A1b/ PPo-A1b/ Dx5基因聚合且为1BL·1RS易位的品种（系）12份,可用于1BL·1RS易位系品质改良的研究。     

大麦条纹病原菌的RAPD遗传多样性分析及大麦亲本抗性评价

为了明确大麦条纹病菌-麦类核菌(Pyrenophora graminea)在甘肃省河西走廊地区不同地理位置的遗传差异性,并鉴定大麦亲本品种对其抗性,运用RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)技术,对甘肃农业大学农学院麦类实验室保存的20个采自河西不同地区的大麦条纹病菌株进行遗传多样性分析,采用"夹心法"对30种大麦亲本材料进行抗性评价。结果表明,在遗传相似系数(GS)为0.7166时可将20个麦类核菌(P.graminea)菌株划分为4类,菌株XTB和JT聚为一类,且这2个菌株的地理位置相隔较远,菌株YC和HYH各自单独为一类,剩余16个菌株聚为一类;20个供试菌株中,菌株QQ和SW、菌株HZ和QWC的遗传相似系数(Genetic Similarity,GS)均为0.936 5,遗传相似性最高,遗传距离值分别为0.052 3和0.045 5。菌株YC的遗传相似系数最小,为0.624 1,与其他菌株间的遗传距离范围是0.372 2～0.633 0,得出不同地理来源的麦类核菌菌株存在一定的遗传差异性;在供试菌株中,菌株CJZ和SW的地理位置接近,遗传距离小,而菌株SW和QWC,HZZ和SW,SSB和HZ之间的地理位置均相隔较远,但两两之间的遗传距离值均较小,得出菌株间地理位置的远近差异与遗传距离的大小无显著相关性。抗性鉴定结果显示,30份供试的大麦亲本品种对菌株QWC的抗病性差异较大,鉴定出6份高感大麦条纹病品种,19份感病品种,5份抗病品种,其中‘Isotta’的抗性最差,‘甘啤6号’抗性最好。综上所述,引起甘肃河西走廊地区大麦条纹病的病原菌群体存在较高遗传差异性,且其亲缘关系的远近与地理差异无明显相关性;鉴定大麦亲本抗性,得到抗感大麦品种组合‘甘啤6号’和‘Isotta’。     

盐生草HgNHX1基因在大麦株系中的功能验证

为了探讨盐和干旱环境胁迫对转盐生草液泡膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HgNHX1大麦幼苗生长及抗逆性生理指标的影响,以转HgNHX1基因大麦及野生型株系为材料,分析盐(150 mmol· L^-1 NaCl)和自然干旱环境下转基因大麦幼苗的生长特性及生理指标的变化。结果表明,在盐胁迫条件下,随着胁迫时间的延长,转基因株系中HgNHX1 基因相对表达量逐渐上升;干旱胁迫条件下,转基因株系中HgNHX1 基因相对表达量呈先上升后下降的趋势,在处理3 d时达到最高。且在胁迫处理的三个不同时间点,转基因株系的相对含水量和游离脯胺酸含量均高于野生型株系,而相对电导率和丙二醛含量均低于野生型株系。这些结果说明,转基因株系中HgNHX1基因能够应答盐和干旱胁迫,具有提高大麦耐盐、抗旱性的功能。     

大麦条纹病侵染对大麦叶片蛋白组的影响

大麦条纹病由麦类核腔菌(Pyrenophora graminea)引起,是一种世界性病害.为进一步探索条纹病与大麦(Hordeum vulgare)的相互作用,以大麦品种甘啤6号和Issto为实验材料,在接种麦类核腔菌(代号DWC)7和21d后提取叶片蛋白,运用2-DE和质谱分析技术研究条纹病菌侵染后叶片蛋白质组学的变化.结果显示,与对照相比,甘啤6号和Isotta差异表达量在1.4倍以上的蛋白点28个,其中在甘啤6号中表达上调的蛋白点4个,下调的6个,诱导表达的2个,抑制表达的2个;在Isotta中,表达上调的蛋白点3个,下调的4个,诱导表达的4个,抑制表达的3个.质谱鉴定分析发现,表达上调的蛋白包括二磷酸核酮糖羧化酶A(2号蛋白点)、肌动蛋白(9号蛋白点)、核糖体再循环因子(ribosome-recycling factor,RRF)(10号蛋白点)、ATP合酶γ链(11和27号蛋白点)、琥珀酸脱氢酶(辅酶q)黄素蛋白亚基(15号蛋白点)和假定蛋白(26号蛋白点):表达下调的包括过氧化物还原蛋白(4号蛋白点)、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit,RuBisCo)(3、5、12、14、16和18号蛋白点)、ATP合酶CF1α亚基(13号蛋白点)、Ycf3蛋白(17号蛋白点)和α-1,4葡聚糖蛋白合酶(alpha-1,4-glucanprotein synthase,UTPG)(28号蛋白点);诱导表达蛋白包括假定蛋白(6号蛋白点)、脂氧合酶2(lipoxygenase 2,LOX2)(7号蛋白点)、捕光叶绿素a/b结合蛋白质(light harvesting chlorophyll a/b-binding protein,LHCP)(19号蛋白点)、3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglycerate kinase,PGK)(20号蛋白点)、凝集素(21号蛋白点)和ATP合酶γ链(22号蛋白点);抑制表达的蛋白包括RuBisCo(1、8、24和25号蛋白点)和二磷酸核酮糖羧化酶小链(ribulose bisphosphate carboxylase small chain,RuBPCase)(23号蛋白点)等.按照其功能分类,这些差异表达蛋白点分别参与了光合作用、蛋白质生物合成、植物防卫反应、能量代谢和细胞信号转导、细胞结构和纤维素生物合成等生理功能.这些差异表达蛋白可能与大麦响应条纹菌侵染过程有关,研究结果有助于从蛋白质水平揭示不同抗性大麦品种抗条纹病的抗性机制.     

玉米逆境响应基因ZmGST23克隆和表达分析

谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)是植物抗氧化系统的重要成员,在初生代谢、次生代谢、细胞信号转导及逆境响应等生物学过程中发挥着重要作用.本研究以GenBank中公布的玉米谷胱甘肽-S-转移酶23基因(ZmGST23)mRNA序列(GenBank登录号:NM_001111524)为依据,采用RT-PCR方法从玉米(Zea mays)自交系F83中克隆得到ZmGST23基因669 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码222个氨基酸,蛋白分子量为24.84kD,理论等电点为5.68.保守结构域分析表明,该基因具有GSTs所特有的N端及C端结构域,并含有典型的G位点及H位点,属于Tau类谷胱甘肽硫转移酶.系统进化分析表明,ZmGST23编码蛋白与高粱(Sorghum bieolor)GST蛋白亲缘关系最近,且在不同物种间存在明显的种属特性.启动子序列分析结果显示,ZmGST23基因启动子区含有多个响应逆境及植物激素的作用元件,包括脱落酸(abscisic acid,ABA)响应元件、生长素(auxin,IAA)响应元件、赤霉素(gibberellin,GA)响应元件、厌氧响应元件、防御及逆境响应元件以及干旱诱导的MYB转录因子(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog,MYB)结合位点.胁迫诱导表达分析表明,ZmGST23的表达显著受干旱脱水、水涝、盐、ABA、IAA、GA、低温及高温等非生物胁迫的诱导.组织特异性表达分析表明,ZmGST23基因在幼芽和成熟叶片中表达量较高,在幼根、花丝、苞叶、雌穗及雄穗中表达量较低,存在明显的组织特异性.将ZmGST23基因片段连接至原核表达载体pEASY-E1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,用0.5 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ3-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达1～4 h后获得30 kD的诱导蛋白.本研究结果为进一步利用该基因进行玉米抗性改良提供了一定的理论依据.     

青稞遗传多样性及其农艺性状与SSR标记的关联分析

利用92个SSR标记对108份青稞亲本材料进行多态性扫描,分析其遗传多样性,旨在寻找与农艺性状相关联的分子标记,为青稞杂交组合的配制及分子标记辅助育种提供依据。挑选48个多态性标记进行群体遗传结构分析,在此基础上采用Tassel 2.1 GLM (general linear model)和MLM (mixed linear model)方法进行标记与农艺性状的关联分析。共检测出156个等位变异,每个位点2~6个等位变异。供试群体的Shannon指数为0.6727~1.1368,材料间遗传相似系数为0.2250~1.0000,平均0.7585。通过群体遗传结构分析将供试材料划分成4个亚群。以GLM分析,发现12个与株高、穗长、穗粒数和分蘖数相关联的标记,对表型变异的解释率分别为11.5%~17.6%、19.4%~45.4%、15.4%~22.1%和29.2%;以MLM分析,发现8个与株高、分蘖数和小穗数相关的标记,各标记对表型变异的解释率分别为31.7%~49.8%、28.1%~37.2%、22.7%~32.7%。关联标记分布在基因组全部6个连锁群上。     

马铃薯黑痣病生防菌的筛选和鉴定及其生长条件的研究

从甘肃省景泰县条山农场不同连作年限的马铃薯地块中取根际土样品,分离筛选马铃薯黑痣病病原菌-立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的拮抗菌。采用土壤平板稀释、对峙法筛选拮抗菌;结合形态特征、生理生化及16Sr DNA分子鉴定;采用单因素试验设计对G1菌株的生长条件进行初步试验。通过初筛和复筛,从108株细菌中获得1株对立枯丝核菌拮抗效果稳定、拮抗能力较强的细菌G1。采用平板对峙法测定其拮抗作用,抑菌带宽度达6mm,抑菌圈直径2.5 cm,抑菌率为66.7%。结合形态特征、生理生化及16Sr DNA分子鉴定,G1为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.);采用单因素试验设计对G1菌株的生长条件进行初步试验。结果表明,菌株G1在4℃~45℃,p H 5~10,盐浓度0~50 g·L-1都能生长,碳源、氮源利用广泛,最适条件为:温度37℃,p H 7,蔗糖为碳源,蛋白胨为氮源,盐浓度为10 g·L-1。拮抗菌G1被鉴定为类芽孢杆菌,该菌株抑菌带较宽、抑菌效果稳定,生长条件与马铃薯生长的大田环境基本相符,具有作为一株优良生防菌的必要条件。